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Études Fonctionnelles Et Structurales Des Complexes De Pré-Intégration Rétroviraux : Import Nucléaire

Reference : PhD Student

Publication de l'offre : 23 mars 2017

Directeur de Thèse : RUFF MARC

 

Une des étapes essentielles dans les étapes précoces de l’infection par les rétrovirus comme HIV est l’intégration du génome viral dans les chromosomes des cellules hôtes. L'intégrase est une protéine présente dans les différentes
étapes de l'infection rétrovirale impliquant le complexe de pré-intégration (PIC). Elle participe ainsi à la transcription inverse, à la migration du PIC le long des microtubules, au transfert vers le noyau, au ciblage de la chromatine et à
l'intégration. L'intégrase est une protéine désordonnée présentant une importante flexibilité inter-domaine.

 

Cette flexibilité permet ses multiples fonctions biologiques et explique sa capacité à interagir avec des partenaires multiples. À chaque fonction de l’intégrase est associée une conformation
structurale propre induite par les molécules partenaires : protéines, ARN, ADN, ainsi que par des modifications post-traductionnelles comme l'acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Nous criblons les différents complexes pour
définir leurs conditions de stabilité et de solubilité optimales qui sont nécessaires pour les études structurales et fonctionnelles.

 

Les résultats déjà obtenus dans le laboratoire ont permis de proposer un modèle pour l’intégration de l’ADN viral dans l’ADN de la cellule hôte (Michel et al., EMBO J, 2009). Un deuxième complexe de l’intégrase en interaction avec deux protéines cellulaires (LEDGF et INI1) et de l’ADN a été résolu en cryo-microscopie électronique (Maillot et al., PLoS ONE, 2013). La stratégie pour la production de complexes stables a été mis au point au laboratoire (Levy et al. Nat. Comm., 2016).

 

L’objectif principal du projet de l’étudiant en thèse est l’analyse structurale et fonctionnelle de complexes d’import et d’export nucléaire du PIC caractérisé dans notre équipe : IN/TNPO3/LEDGF et IN/TNPO3/VBP1. Les techniques utilisées
vont du clonage à l’étude structurale en passant par la production de protéine ainsi que la caractérisation physico-chimique et fonctionnelle. Les études structurales seront principalement effectuées par cryo-microscopie
électronique. Les complexes seront produits dans deux organismes, E. Coli et cellules de mammifères. La purification sera réalisée par chromatographie d’affinité suivit
par une filtration sur gel, et suivant les cas par une autre étape de purification (interaction hydrophobe, échange d’ion).
De manière transversale nous utilisons des techniques de caractérisation structurale et physicochimique (ES-MS, Trypsin digestion /MALDI, High Mass MALDI-TOF, RMN, microscopie électronique, ultra centrifugation analytique…).

 

L’étude fonctionnelle des complexes se fait en analysant leurs capacités à fixer l’ADN viral par des techniques d’anisotropie et de corrélation de fluorescence. Les études structurales se font avec diverses techniques : cryo-microscopie électronique (titan cryos), radiocristallographie (lignes de lumière synchrotron
et robot pour la validation des cristaux et l’acquisition automatique des données de diffraction) et diffusion des RX aux petits angles (SAXS) pour la caractérisation et les études en solution.

 

Compétences

 

Biologie moléculaire et structurale, physico-chimie, biophysique, biochimie.

 

Expertises

 

Production et purification de complexes multi-protéiques. Utilisation de systèmes d’expression procaryotes et eucaryotes. Caractérisation de complexes par des méthodes biochimiques et biophysiques. Détermination de structure par cryo-microscopie électronique et cristallographie, étude des relations structure/
fonction.

Votre candidature

Date limite de candidature : 1 novembre 2017

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