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Analyse Quantitative De L'Adaptation Au Stress Oxydant Chez Le Nématode Dans Un Dispositif Microfluidique

Reference : PhD Student

Publication de l'offre : 21 mars 2017

Un des défis auxquels les êtres vivants sont confrontés est de survivre aux variations de l’environnement dans lequel ils se trouvent. Notre laboratoire vient de démontrer que la levure de boulanger S. cerevisiae est capable de développer une homéostasie adaptative lorsqu’on lui fait subir un stress
oxydant graduel.

 

Ainsi, lorsqu’on les expose à une dose croissante de peroxyde
d’hydrogène (H2O2), les levures deviennent à même de supporter une dose presque 10 fois supérieure à la dose létale. Cette adaptation résulte d’une dégradation non linéaire de la concentration interne de H2O2, assurée par la péroxiredoxine Tsa1, dont la transcription est contrôlée par le facteur de
transcription Yap1 (Goulev et al., article en révision, Elife).
Or, les gènes de réponse au stress sont hautement conservés, de la levure à l’homme. Ce projet de thèse a donc pour but de tester si un organisme multicellulaire simple, tel que le nématode C. elegans, est capable de s’adapter à un stress oxydant graduel. Tout comme pour la levure, une approche microfluidique sera déployée pour opérer un contrôle très précis de
l’environnement, tout en permettant une imagerie optimale.

 

L’étudiant testera d’abord si des animaux jeunes adultes sauvages sont capables de survivre à une dose de H2O2 supérieure à la dose létale, lorsque le stress est appliqué
graduellement sur plusieurs heures. Il quantifiera la survie des animaux, leur fertilité et leur longévité. En outre, l’activation en temps réel des principaux gènes de réponse au stress sera analysée par vidéo-microscopie grâce à des rapporteurs fluorescents, afin de caractériser l’activation séquentielle des
facteurs de transcription mis en jeu (SKN-1/Nrf et DAF-16/FOXO), ainsi que celle de la péroxiredoxine, qui joue un rôle clef chez la levure. Si des rapporteurs existent déjà pour certains de ces gènes, leur niveau d’expression ne reflète pas
le niveau endogène, en particulier celui de la péroxiredoxine, hautement surexprimé.

 

Aussi, l’étudiant construira de nouveaux rapporteurs au moyen
d’une approche CRISPR/Cas9, qui permet l’insertion de la GFP (/mCherry) dans le gène d’intérêt par ’knock-in’, reflétant ainsi un niveau d’expression fidèle.
Trois nouvelles lignées rapporteuses sont ainsi prévues, incluant les orthologues de Yap1 et Tsa1 —respectivement SKN-1::mCherry et PRDX-2 ::GFP— ainsi que DAF-16::GFP, facteur de transcription équivalent à Msn2 chez la levure. Les
lignées seront croisées entre elles afin de pouvoir suivre simultanément SKN-1 et DAF-16, et SKN-1 et PRDX-2. L’étudiant filmera ces marqueurs par vidéomicroscopie confocale et quantifiera avec précision leur expression, recherchant lequel se transloque en premier dans les noyaux intestinaux, signal de son
activation. Ce travail permettra aussi de préciser les expressions relatives de SKN-1 et PRDX-2, afin de déterminer si la péroxiredoxine agit plutôt comme une cible ou comme un régulateur de SKN-1/Nrf. Enfin, le recours à des mutants
dans ces gènes permettra de caractériser les voies moléculaires mises en jeu, lors de l’homéostasie adaptative.

 


Ce projet de thèse permettra donc de décrire comment un multicellulaire peut s’adapter à un stress graduel, une question peu explorée en raison de ses difficultés techniques. Notre laboratoire constitue l’environnement idéal pour la réalisation de ces travaux. Enfin, l’étudiant qui aura accompli ce projet sera doté de compétences multiples dans différents domaines, incluant la microfluidique, la transgenèse et la génétique de C. elegans, autant de savoir-faire qui lui seront utiles pour sa carrière scientifique future.

 

Compétences

Biologie moléculaire
Microscopie
Analyse d'image
Biologie du développement

 


Expertises

 

Microfluidique
Analyse d'images avec Matlab
Biologie des systèmes

Votre candidature

Date limite de candidature : 1 novembre 2017

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