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Mécanismes De Régulation D'Aid Lors De La Commutation Isotypique

Reference : PhD Bernardo REINA-SAN-MARTIN

Publication de l'offre : 6 avril 2016

Lors des réponses immunes, le répertoire des cellules B est diversifié par l'hypermutation somatique (HMS) et la commutation isotypique (CI) afin de générer une immunité humorale spécifique et adaptée. L'HMS modifie l’affinité du récepteur B afin de générer des anticorps de haute affinité. La CI est un événement de recombinaison qui remplace l'isotype exprimé (de IgM vers IgG, IgE ou IgA), modulant ainsi les fonctions
effectrices des anticorps tout en conservant la spécificité du récepteur.

Alors que les modifications à l'ADN qui résultent de ces processus sont clairement distinctes, ces réactions sont strictement dépendantes de l'expression d'Activation Induced Cytidine Deaminase (AID). AID déclenche ces réactions en désaminant cytosines dans l'ADN. Ces lésions sont reconnues par la machinerie de réparation de l’ADN et sont processées de manière différente afin d’introduire des mutations ou de générer des cassures double brin lors de la CI. L'activité enzymatique d'AID possède donc un potentiel mutagénique important qui peut conduire à des translocations et à la transformation cellulaire. A présent il n'est pas compris comment AID est spécifiquement ciblée vers les gènes des immunoglobulines ou comment les dommages collatéraux à d'autres gènes sont restreints.

L'objectif du projet est d'identifier les protéines qui s'associent à AID, qui régulent potentiellement son activité, et étudier leur rôle dans la commutation isotypique. Pour ce faire nous utiliserons la lignée CH12, un lymphome B murin dans lequel la CI peut être induite de manière très efficace in vitro et qui exprime AID à des niveaux physiologiques. Afin d'identifier les partenaires d'AID, nous utiliserons le système CRISPR/Cas9 pour introduire dans
l'exon1 d'AID la séquence codant pour à la biotin ligase mutante BirA*. Celle-ci est capable de bioninyler les protéines se trouvant à proximité. L'expression de BirA*-AID nous permettra alors de purifier les protéines biotinylées (se trouvant à proximité d'AID) à l'aide de billes magnétiques couplées à la streptavidine et de les identifier par spectrométrie de masse.

Nous proposons alors d’étudier le rôle fonctionnel dans la commutation isotypique des candidats identifiés le plus prometteurs en générant des knockouts à l'aide du système CRISPR/Cas9. Nous concentrerons nos efforts en étudiant les différentes étapes de la recombinaison (transcription des régions de switch, expression d'AID, recrutement d'AID au locus IgH,
formation et réparation des cassures double brin à l'ADN) par des approches de génomique fonctionnelle comprenant ChIP-Seq et 4C-Seq, entre autres.

- COMPETENCES SOUHAITEES : Expérience en Biologie moléculaire, biochimie et culture cellulaire.

- EXPERTISES QUI SERONT ACQUISES AU COURS DE LA FORMATION : Formation solide en Immunologie, biologie moléculaire, biochime et réparation de l’ADN.

Votre candidature

Date limite de candidature : 31 décembre 2016

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