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Etude Des Mécanismes Impliqués Dans Le Maintien De La Stabilité Génomique Durant Les Processus De Diversification Des Immunoglobulines

Reference : PhD Bernardo REINA-SAN-MARTIN

Publication de l'offre : 6 avril 2016

Au cours de la réponse immunitaire, la diversification du répertoire des lymphocytes B est initiée par le recrutement de l’enzyme «Activation Induced Cytidine Deaminase» (AID) au locus de la chaine lourde des immunoglobulines (IgH) et par la génération des cassures double brin à l’ADN médiée par AID. Le modèle actuel concernant le ciblage génomique d’AID propose que cette enzyme soit recrutée à proximité des régions promotrices de gènes activement transcrits et dans lesquelles l'ARN polymérase II est en pause.

Cependant, bien que ce modèle explique plusieurs des caractéristiques des processus d’hypermutation somatique (HMS) et de commutation isotypique (CI), ni le recrutement seul d’AID, ni la transcription per se ne semblent être suffisants pour expliquer la régulation optimale de l’activité d’AID. En effet, d’une part, de nombreux gènes activement transcrits dans les cellules B activées ne constituent pas des cibles d’AID. D’autre part, tous les gènes cibles d’AID ne sont pas mutés par AID.

De plus, bien qu’AID puisse être recrutée à de nombreux loci autres que ceux des immunoglobulines (Ig), ces locis sont mutés à des fréquences plus faibles comparées à celles des mutations touchant les gènes des Ig. Notre hypothèse est qu’ils existent des mécanismes additionnels, consécutifs au recrutement d’AID, qui contrôlent et déterminent l’activité d’AID au niveau des loci Ig par rapport aux cibles non-Ig.

A l’heure actuelle, les mécanismes responsables de ce choix différentiel restent inconnus. Aussi, pour mieux comprendre ces évènements, nous proposons d’identifier les protéines qui sont recrutées au locus IgH et de les comparer à celles recrutées à un locus non-Ig ciblé par AID. Pour cela, nous utiliserons un
système novateur que nous avons développé dans lequel nous avons couplé la technologie d'identification de protéines par biotinylation à proximité (Bio-ID) au système CRISPR/Cas9. Le système est basé sur la lignée cellulaire CH12, un lymphome B murin dans lequel la CI peut être induite de manière très efficace in vitro. Cette lignée exprime un mutant catalytique de la nuclease Cas9 (Dead Cas9, dCas9) fusionnée à la biotin ligase
mutante BirA*. Celle-ci est capable de bioninyler les protéines se trouvant à proximité de la protéine cible (dCas9).

Ainsi, la chromatine ciblée par AID et liée par la protéine de fusion BirA*-dCas9 peut être purifiée par affinité en utilisant des billes couplées à la streptavidine. Les protéines isolées
seront alors identifiées par spectrométrie de masse). Enfin, l’implication et le rôle fonctionnel des protéines ainsi identifiées seront caractérisés dans les processus de CI et de réparation de l’ADN, au moyen de modèles cellulaires d’inactivation générés avec le système CRISPR/Cas9.

- COMPETENCES SOUHAITEES : Expérience en biologie moléculaire, biochimie et culture cellulaire.

- EXPERTISES QUI SERONT ACQUISES AU COURS DE LA FORMATION : Formation solide en immunologie, biologie moléculaire, biochimie et réparation de l’ADN.

Votre candidature

Date limite de candidature : 31 décembre 2016

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