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Etude Structurale De Complexes Multi Protéiques De Réparation De D'Adn De La Voie Ner: Comment Sont Éliminés Les Dommages Induits Par Sels De Platine Utilisés En Chimiothérapie?

Reference : PhD Arnaud POTERSZMAN

Publication de l'offre : 30 avril 2016

Les réponses aux dommages de l’ADN sont essentielles au maintien de l’intégrité du génome et des altérations des mécanismes de réparation ont un rôle causal dans le développement de cancers. Ce projet porte sur la voie de réparation par excision-resynthèse de nucléotides (NER) qui corrige les lésions de l’ADN induites par les UV ainsi que par de nombreuses molécules utilisées en chimiothérapie. Un défi important dans un proche avenir sera de développer de nouvelles molécules grâce à des approches rationnelles basées sur la connaissance des structures 3D et des
mécanismes catalytiques.

Nous nous intéressons au facteur de transcription/réparation TFIIH qui dans ce contexte permet l'ouverture de la double
hélice d'ADN au niveau de la lésion et joue un rôle central dans l'assemblage du complexe de pré-incision, en particulier dans le recrutement de l'endonucléase XPG. TFIIH, dont 3 de ses 10 sous-unité portent des mutations chez des patients atteints de Xeroderma Pigmentosum, est organisé en deux modules fonctionnels: core-TFIIH composé de 6 sous-unités dont l’hélicase XPB et le module kinase (CAK). L’hélicase XPD dont l'activé hélicase est essentielle pour la réaction NER relie le core-TFIIH et le CAK.

A la suite des travaux effectués dans l'équipe une technologie permettant la production du complexe core-TFIIH recombinant à une échelle compatible avec des études structurales a été développée. Un premier volet du travail de thèse proposé ici portera sur l'étude structurale par cryo-microscopie
électronique (cryo-EM) du core-TFIIH ainsi que sur des complexes de taille plus importante dont le facteur TFIIH entier ou le complexe TFIIH/XPG composé de 11 sous-unités. Ces données seront complétées par des études biophysiques en solution et des expériences de pontage chimique couplées à des analyses par spectrométrie de masse pour établir une cartographie des interactions protéine-protéine. Une attention particulière sera portée sur XPB qui est la cible du triptolide (TP), une molécule possédant des activités anti- inflammatoires et anti-cancéreuses. Cette molécule sera utilisée comme sonde pour étudier sous un angle nouveau les activités catalytiques de TFIIH et leur régulation et des essais de cristallisation du
domaine catalytique ATPase d’XPB seront réalisés en présence de TP pour en déterminer la structure et à terme, développer de nouvelles molécules anticancéreuses ciblant TFIIH.
Le second volet du travail aura pour objectif d'étudier comment TFIIH est recruté au niveau du dommage et préciser son rôle dans l'assemblage du complexe de pré-incision en combinant des approches biochimiques et biophysiques. Des fragments d'ADN portant portant une lésion cis-platine localisée au milieu de la séquence seront utilisés pour préparer des complexes stables impliquant TFIIH en vue d'expériences de pontage chimique et d'études structurales par cryo-EM. Il s'agira en particulier de mieux comprendre comment TFIIH est recruté par le complexe de reconnaissance du dommage XPC/HR23B, de préciser le rôle des facteurs RPA et XPA et d'étudier les changements conformationels induits par la fixation d'ATP et/ou
l'inhibition par le TP.

De nombreux agents utilisés en chimiothérapie, dont le cis-platine, agissent via la formation d’adduits encombrants et sont réparés par la voie NER. Pour certains cancers, la capacité des cellules à réparer est inversement corrélée au succès du traitement et inhiber la voie NER devrait pouvoir en augmenter l’efficacité. Afin de développer de nouvelles drogues capables d’interférer avec cette voie de réparation, l’étude des relations
structure-fonctions pour ses composantes est essentielle.

Missions

COMPETENCES SOUHAITEES : Biologie moléculaire et cellulaire et/ou structurale. Forte motivation pour des questions fondamentales en biologie.

- EXPERTISES QUI SERONT ACQUISES AU COURS DE LA FORMATION : Production et purification de complexes multi-protéiques. Utilisation de systèmes d’expression procaryotes et eucaryotes. Caractérisation de complexes par des méthodes biochimiques (immuno-précipitations, gel-retard, SPR, tests fonctionnels …) et biophysiques (gel-filtration, diffusion de lumière, ultracentrifugation analytique, SANS, SAX…). Détermination de structure par cryo-EM, étude des relations structure/fonction. Biologie structurale, Réparation de l’ADN, Complexes

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Date limite de candidature : 31 décembre 2016

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